準備

・ タンパク質SDS-Pageの一次元電気泳動したゲルをCBB染色する
・ イメージスキャナ：透過原稿対応スキャナ セイコーエプソン社製　ES-2000を使用
・ スキャナドライバ：EPSON Scan (Version 3.04J)、もしくは「スキャナ駆動ソフトウェアiMeasure Scan」

【スキャン時の留意点】

「自動露出」をかけないようにする。
そのために、「ドライバによる色補正」をOFFにする。もしくは、自動露出をかけずに［RESET］ボタンを押すこと。
解像度：300dpi
イメージタイプ：16bit GrayScale , ドロップアウトカラー Red
・ 電気泳動ゲル解析ソフトウェア：NIH ImageJ (Version 1.41)
下記URLよりダウンロード
・ImageJフリーウェア//imagej.nih.gov/ij/

１．ImageJにてファイルを開く

２．透過率に換算するために最大値を確認する

Lineツールにてタンパク質のバンドの部分に線を引く。
Analyze＞Plot Profile (Ctrl+K)

※8bit データの場合　：0~255、16bit データの場合：0~65535
※このファイルは、8bitデータなので、最大値255。

３．イメージタイプを３２ｂｉｔに変更する

Image＞Type＞32-bit
※計算誤差を無くすためbit数をあげる。

４．光学濃度に換算する

計算式　【　OD　＝　-1 * (1.8) * ln ( value / 255 ) / ln(10) 　】
※EPSON Scanner ドライバのデフォルトガンマは、1.8。
※リニアガンマ（＝1.0）でスキャンファイル出力可能であれば1.8は不要。
スキャナ駆動ソフトウェアiMeasure ScanにてDensitometor ONとした場合、スキャナガンマは、1.0となるため計算式の1.8は不要。
詳細は「イメージスキャナ駆動ソフトウェア」を参照。
iMeasure Scan Lite は、vectorからも購入可能となります。
※ImageJの対数計算式は(Logという表記ですが)、Ln(常用対数)です。自然対数にするため、ln(10)で割る。

４-１．最大値で割る

Process＞Math＞Divide 255

４-２．対数変換する

Process＞Math＞Log

４-３．Ln対数からLog対数に変換

Ln(10)=2.3025851で割る。
Process＞Math＞Divide 2.3025851

４-４．［1.8］を掛ける

Process＞Math＞Multiply 1.8

４-５．［-1］を掛ける

Process＞Math＞Multiply –1

４-６．値を確認する

Lineツールにてタンパク質のバンドの部分に線を引く。
Analyze＞Plot Profile (Ctrl+K)

※CBB染色のOD値は、最大でも0.5程度。

５．タンパク質のOD積分値を算出する

画像を見やすくする
Image＞Adjust＞Brightness/Contrast [Ctrl+Shift+C]

Autoボタンを押す。
B＆Cダイアログのヒストグラムを見ながら、Minimum Maximumスライダーを動かして、「ヒストグラムをはさむ」ようにする。
Brightness, Contrastは触らないこと。
※ImageJのBrightness/Contrast　による画像操作は、元画像のデータを変更することなく、「見た目」を変えるだけなので、安心して操作する。
※Applyを押してもオリジナル画像のデータは影響を受けない。

５-２．SDS-Page各レーン（バンド）の狙いのタンパクを囲む

今回は、タンパク質分子量　50KDa　を計測した。

５-２-１．レーン＃１を囲む

Analyze＞Gels＞Select First Lane (Ctrl+1)

囲った□の中に番号が発生する。

番号の発生した□をブラウスすると、既に複製された□枠が移動する。

５-２-２．レーン＃２を囲む

レーン＃２の、５０ｋＤａのバンドを囲む場所まで移動する。
Analyze＞Gels＞Select Next Lane (Ctrl+2)

引き続き、レーン＃３〜レーン＃９まで囲む。
Analyze＞Gels＞Select Next Lane (Ctrl+2)

５-２-３．ゲル専用の連続[ Plot Profile ]機能を使う

Analyze＞Gels＞Plot Lanes (Ctrl+3)

一度に、全レーンの積分濃度のグラフが連続発生する。

５-３-１．OD積分を算出する

ラインツールを選び、レーン＃１のPlot Profile の山のみの積分値を算出するために、ベースラインを引く。
この時、山の内部が、線で囲まれて「空間が閉じた状態」となるように留意する。
失敗したら、キャンセルして線を引き直す。
※ゲル画像上下方向の断面が(Plot Profileにて左右に)表示される。
※ゲル画像左右方向は加算される。

５-３-２．山の面積（OD積分）を算出する

魔法の杖（正式名称は不明？）を選び、山の内部を１回クリックする。
直ちに、Results ダイアログが開き、面積の計算値が表示される。

５-３-３．レーン数だけOD積分を算出する

山が次第に小さくなるので、拡大ツールを使って Plots of .. ダイアログを拡大して、山のベースラインを引く。

６．ファイル保存する

全てのレーンのOD積分を算出し終えたら、測定値をファイルに保存する。
CSV形式で保存されるので、Excellなどの表計算ソフトで開くことができる。
Result　ダイアログ（OD積分値の数値が記載された画面）にて、File＞Save As

７．検量線を引く

先に保存したOD積分値ファイルをExcellなどの表計算ソフトで開く。
横軸をゲルの各レーンに投入したタンパク質量　[ng/band]、縦軸に、計測したOD積分値　としてグラフを作成する。
近似式を作成し、相関係数を調べる。

相関係数：0.9936
※相関係数が、１から大きくはずれている場合、次の原因が考えられる。
（１）スキャナの特性が想定外の挙動。
例えば、自動露出が行われていて、勝手にコントラスト強調が行われているなど。
（２）OD値に換算できていない。（Logの計算が抜けている）
OD値ではなく、スキャナの読み値のままの場合、特に高濃度側（グラフ右側）の点が右肩下がりになる。
以上で基本操作は完了です。　お疲れ様でした。

８．検証

対数軸にして表示。

※最も淡いレーン（7.8ng/band）以外は信用できる？
OD積分値は、絶対値ではなく相対値である。
つまり、山の面積を算出する度に異なる値となる。
そこで、タンパク質量の相対比は、繰り返し再現性があるかどうか、チェックした。
実験：レーン#3とレーン#5のみで解析をして、OD積分値の比率を算出。

レーン#3の積分値は、先の値（1894）から 4448に変わっているがレーン#3のOD積分値に対するレーン#5のOD積分値は 18.3％であり、先の実験結果 18.2％と精度良く一致する。