REPORT
ImageJによるCBB　SDS-Page　ゲルの検量線の作成アイメジャー株式会社　2009.2.1

準備

・ タンパク質SDS-Pageの一次元電気泳動したゲルをCBB染色する
・ イメージスキャナ：透過原稿対応スキャナ セイコーエプソン社製　ES-2000を使用
・ スキャナドライバ：EPSON Scan (Version 3.04J)　もしくは、 スキャナ駆動ソフトウェアiMeasure Scanスキャナ駆動ソフトウェアiMeasure Scan
【スキャン時の留意点】
「自動露出」をかけないようにする。
そのために、「ドライバによる色補正」をOFFにする。もしくは、自動露出をかけずに［RESET］ボタンを押すこと。
解像度：300dpi
イメージタイプ：16bit GrayScale , ドロップアウトカラー Red
・ 電気泳動ゲル解析ソフトウェア：NIH ImageJ (Version 1.41)
下記URLよりダウンロード
・ImageJフリーウェアhttps://imagej.nih.gov/ij/

１．ImageJにてファイルを開く

ImageJにてファイルを開く

２．透過率に換算するために最大値を確認する

透過率に換算するために最大値を確認する

Lineツールにてタンパク質のバンドの部分に線を引く。
Analyze＞Plot Profile (Ctrl+K)

Ｌｉｎｅツールにてタンパク質のバンドの部分に線を引

※8bit データの場合　：0~255、16bit データの場合：0~65535
※このファイルは、8bitデータなので、最大値255。

３．イメージタイプを３２ｂｉｔに変更する

イメージタイプを３２ｂｉｔに変更する

Image＞Type＞32-bit
※計算誤差を無くすためbit数をあげる。

４．光学濃度に換算する

計算式　【　OD　＝　-1 * (1.8) * ln ( value / 255 ) / ln(10) 　】
※EPSON Scanner ドライバのデフォルトガンマは、１．８
※リニアガンマ（＝１．０）でスキャンファイル出力可能であれば１．８は不要。
スキャナ駆動ソフトウェアiMeasure ScanにてDensitometor ONとした場合、スキャナガンマは、１．０となるため計算式の１．８は不要。
詳細は、『イメージスキャナ駆動ソフトウェア』を参照。
iMeasure Scan Lite は、vectorからも購入可能となります。
※ImageJの対数計算式は(Logという表記ですが)、Ln(常用対数)です。自然対数にするため、ln(10)で割る。

４-１．最大値で割る

Process＞Math＞Divide 255

最大値で割る 最大値で割る

４-２．対数変換する

Process＞Math＞Log

対数変換する

４-３．Ln対数からLog対数に変換

Ln(10)=2.3025851で割る。
Process＞Math＞Divide 2.3025851

Ln対数からLog対数に変換

４-４．［1.8］を掛ける

Process＞Math＞Multiply 1.8

４-５．［-1］を掛ける

Process＞Math＞Multiply –1

［-１］を掛ける

４-６．値を確認する

Lineツールにてタンパク質のバンドの部分に線を引く。
Analyze＞Plot Profile (Ctrl+K)

値を確認する

※CBB染色のOD値は、最大でも0.5程度。

５．タンパク質のOD積分値を算出する

５-１．画像を見やすくする

Image＞Adjust＞Brightness/Contrast [Ctrl+Shift+C]

画像を見やすくする

Autoボタンを押す。
B＆Cダイアログのヒストグラムを見ながら、Minimum Maximumスライダーを動かして、「ヒストグラムをはさむ」ようにする。
Brightness, Contrastは触らないこと。
※ImageJのBrightness/Contrast　による画像操作は、元画像のデータを変更することなく、「見た目」を変えるだけなので、安心して操作する。
※Applyを押してもオリジナル画像のデータは影響を受けない。

５-２．SDS-Page各レーン（バンド）の狙いのタンパクを囲む

今回は、タンパク質分子量　５０ＫＤａ　を計測した。

５-２-１．レーン＃１を囲む

Analyze＞Gels＞Select First Lane (Ctrl+1)

レーン＃１を囲む

囲った□の中に番号が発生する。

囲った□の中に番号が発生する

番号の発生した□をブラウスすると、既に複製された□枠が移動する。

５-２-２．レーン＃２を囲む

レーン＃２の、５０ｋＤａのバンドを囲む場所まで移動する。
Analyze＞Gels＞Select Next Lane (Ctrl+2)

レーン＃２を囲む

引き続き、レーン＃３〜レーン＃９まで囲む。
Analyze＞Gels＞Select Next Lane (Ctrl+2)

５-２-３．ゲル専用の連続[ Plot Profile ]機能を使う

Analyze＞Gels＞Plot Lanes (Ctrl+3)

ゲル専用の連続[ Plot Profile ]機能を使う

一度に、全レーンの積分濃度のグラフが連続発生する。

全レーンの積分濃度のグラフが連続発生する

５-３-１．OD積分を算出する

ラインツールを選び、レーン＃１のPlot Profile の山のみの積分値を算出するために、ベースラインを引く。
この時、山の内部が、線で囲まれて「空間が閉じた状態」となるように留意する。
失敗したら、キャンセルして線を引き直す。
※ゲル画像上下方向の断面が(Plot Profileにて左右に)表示される。
※ゲル画像左右方向は加算される。

OD積分を算出する

５-３-２．山の面積（OD積分）を算出する

魔法の杖（正式名称は不明？）を選び、山の内部を１回クリックする。
直ちに、Results ダイアログが開き、面積の計算値が表示される。

山の面積（OD積分）を算出する

５-３-３．レーン数だけOD積分を算出する

山が次第に小さくなるので、拡大ツールを使って Plots of .. ダイアログを拡大して、山のベースラインを引く。

レーン数だけOD積分を算出する

６．ファイル保存する

全てのレーンのOD積分を算出し終えたら、測定値をファイルに保存する。
CSV形式で保存されるので、Excellなどの表計算ソフトで開くことができる。
Result　ダイアログ（OD積分値の数値が記載された画面）にて、File＞Save As

ファイル保存する

７．検量線を引く

先に保存したOD積分値ファイルをExcellなどの表計算ソフトで開く。
横軸をゲルの各レーンに投入したタンパク質量　[ng/band]、縦軸に、計測したOD積分値　としてグラフを作成する。
近似式を作成し、相関係数を調べる。

検量線を引く

相関係数：0.9936
※相関係数が、１から大きくはずれている場合、次の原因が考えられる。
（１）スキャナの特性が想定外の挙動。
例えば、自動露出が行われていて、勝手にコントラスト強調が行われているなど。
（２）OD値に換算できていない。（Logの計算が抜けている）
OD値ではなく、スキャナの読み値のままの場合、特に高濃度側（グラフ右側）の点が右肩下がりになる。
以上で基本操作は完了です。　お疲れ様でした。

８．検証

対数軸にして表示。

対数軸にして表示

※最も淡いレーン（7.8ng/band）以外は、信用できる？
OD積分値は、絶対値ではなく相対値である。
つまり、山の面積を算出する度に異なる値となる。
そこで、タンパク質量の相対比は、繰り返し再現性があるかどうか、チェックした。
実験：レーン＃3とレーン＃５のみで解析をして、OD積分値の比率を算出。

OD積分値の比率を算出

レーン３の積分値は、先の値（1894）から、４４４８に変わっているが、レーン＃３のOD積分値に対する、レーン＃5のOD積分値は、18.3％であり、先の実験結果、１８．２％と精度良く一致する。

以上